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      技術文章

      美國nightsea SFA DFP熒光濾光片的選擇指南

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         由于GFP(綠色熒光蛋白)和其他綠色發光體(例如FITC)是使用泛的熒光染料,因此我們的寶藍色激發/發射裝置是體視鏡熒光適配器常用的選擇。在黃色Longpass和綠色bandpass屏障濾波器選項之間進行選擇時,經常會要求我們提供建議。本文將介紹每種方法的優缺點。

      光譜特性

      • Longpass –傳輸所有大于500nm的波長
      • bandpass –僅在500 – 560nm之間傳輸

      長波和帶通濾光片,用于寶藍色激發

      實際上,這意味著bandpass僅傳輸綠色波長,而Longpass則傳輸綠色,黃色,橙色和紅色。

      濾光片作用

           熒光應用中任何濾光片的目的都是為了增加您想要看到的東西(“信號”)的觀看對比度。主要工作是阻擋來自激發源的反射光并透射熒光發射。其他潛在的干擾源(“噪聲”)是觀看區域中其他物質的熒光,這些物質可以掩蓋目的信號。這可能是來自諸如生長培養基(與秀麗隱桿線蟲一起使用時)或對象本身的一部分(例如植物中的葉綠素或發育中的斑馬魚卵黃)之類的背景熒光。

      Longpass濾光片和bandpass濾光片都可以很好地阻擋激發光。

      盡管您可能會認為選擇與預期釋放量緊密匹配的濾光片會更好,但這并非總是如此。

          如果您要消除的噪聲與信號沒有重疊,則bandpass是一個不錯的選擇。例如,在擬南芥或其他植物中,葉綠素發出的紅色熒光就是這種情況,如下圖所示*。葉綠素發出遠紅色的光,其峰值在約685 nm處。在使用Longpass濾光片制作的左側圖像中,紅色熒光難以區分綠色GFP熒光。綠色的bandpass濾光片消除了這種情況,使您很容易看到葉子中的GFP熒光。

       

      用長通濾光片成像的擬南芥熒光(c)夜海
      帶通濾光片對擬南芥熒光成像(c)夜海

            如果噪聲與信號頻譜重疊,則bandpass濾波器可能會引起混淆。使用Longpass濾波器,您可以通過兩種潛在的方式將信號與噪聲區分開:強度和 顏色。使用bandpass濾鏡,您可以刪除顏色(光譜),而僅保留強度。下面的熒光轉基因斑馬魚圖像說明了這一點。這條魚**在心臟中表達GFP,在血細胞中表達mCherry。下圖是兩幅圖像的合成-一幅是使用Longpass濾波器拍攝的,另一幅是使用綠色bandpass濾波器拍攝的。

      通過長通(頂部)和帶通濾光片拍攝的轉基因熒光斑馬魚

      通過Longpass(頂部)和bandpass濾光片拍攝的轉基因熒光斑馬魚

           在頂部圖像中,您可以看到綠色熒光的心臟,紅色熒光的血細胞和蛋黃的天然黃色熒光。這些很容易區分。在下部圖像中,所有內容均以不同的綠色強度顯示。心臟明亮,但蛋黃沒有那么暗。說所有綠色都與GFP表達有關是不正確的。在這種情況下,*使用Longpass濾鏡觀看物體。

            在某些情況下,選擇不太明顯。秀麗隱桿線蟲的生長培養基具有一些背景綠色熒光。與黃色長通相比,綠色bandpass濾鏡確實增加了一些清晰度和對比度。在許多測試中,我們讓數名觀察員觀察了相同的樣本。有些人喜歡長通,因為他們認為這實際上有助于查看背景的某些背景,而另一些人則喜歡同一樣品的帶通。在這種情況下,很可能還有其他選擇,選擇并不完全明顯,可能取決于個人喜好。

      如果您正在自然探索熒光?長傳肯定是要走的路。您無法使用帶通濾鏡捕獲此草花的圖像。

      顯微鏡下的香薊屬,熒光(c)Charles Mazel

       

      擬南芥  由波士頓大學的John Celenza博士提供。

      **斑馬魚由Martha Marvin博士(威廉姆斯學院)提供,這是由Lara Hutson博士(布法羅大學)培育的轉基因品系。
       

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